藥用注射級(jí)蛋黃卵磷脂藥典檢測(cè)方法

[93685-90-6]

　　本品系以雞蛋黃或蛋黃粉為原料，經(jīng)適當(dāng)溶劑提取精制而得的磷脂混合物。按無(wú)水物計(jì)算，含氮（N）應(yīng)為1.75%~1.95%，磷（P）應(yīng)為3.5%~4.1%，磷脂酰膽堿不得少于68%，磷脂酰乙醇胺不得過(guò)20%，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的總量不得少于80%。

　　【性狀】本品為乳白色或淡黃色粉末狀或蠟狀固體；具有輕微的特臭。

　　本品在乙醇、乙、三或石油醚（沸程40~60℃）中溶解，在丙酮和水中幾乎不溶。

　　酸值 本品的酸值（通則0713）應(yīng)不大于20.0。

　　碘值 本品的碘值（通則0713）應(yīng)為60~73。

　　過(guò)氧化值 取本品2.0g，精密稱(chēng)定，置250ml碘瓶中，依法測(cè)定（通則0713），過(guò)氧化值應(yīng)不大于3.0。

　　皂化值 本品的皂化值（通則0713）應(yīng)為195~212。

　　【鑒別】（1）取本品0.1g，置坩堝中，加碳酸鈉-碳酸鉀（2:1）3g，混勻，微火加熱，產(chǎn)生的氣體能使?jié)櫇竦募t色石蕊試紙變藍(lán)。

　?。?/span>2）取鑒別（1）項(xiàng)下遺留的殘?jiān)s100mg，緩緩灼燒至炭化物全部消失，放冷，加水30ml，微熱使殘?jiān)芙?，濾過(guò)，濾液置試管中，滴加硫酸至無(wú)氣泡產(chǎn)生，再加硫酸4滴，加鉬酸鉀少許，加熱，應(yīng)呈黃綠色。

　　（3）在磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。

　　【檢查】游離脂肪酸      對(duì)照品溶液的制備       稱(chēng)取棕櫚酸0.512g，置50ml量瓶中，加正庚烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，置50ml量瓶中，用正庚烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

　　供試品溶液的制備   取本品約1g，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加異丙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

　　測(cè)定法   精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1ml，分別置20ml具塞試管中，各加異丙醇-正庚烷-0.5mol/L硫酸溶液（40∶10∶1）混合溶液5.0ml，振搖1分鐘，放置10分鐘。供試品溶液管精密加正庚烷3ml和水3ml，對(duì)照品溶液管精密加正庚烷2ml和水4ml，密塞，上下翻轉(zhuǎn)10次，靜置至少15分鐘，使分層。分別精密量取上層液3ml，置10ml離心管中，加尼羅藍(lán)指示液（取尼羅藍(lán)0.04g，加水200ml，使溶解后，加正庚烷100ml振搖，棄去上層正庚烷。反復(fù)操作4次。取下層水溶液20ml，加無(wú)水乙醇180ml，混勻。本液置棕色瓶中，室溫下可存放1個(gè)月）lml，在通氮條件下，用氫氧化鈉滴定液（0.01mol/L）滴定至溶液顯淡紫色。供試品溶液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01mol/L）的毫升數(shù)不得大于對(duì)照品溶液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01mol/L）的毫升數(shù)（1%）。

　　甘油三酸酯、膽固醇與棕櫚酸    取本品適量，加正己烷-異丙醇-水（40∶50∶8）混合溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中含20mg的溶液，作為供試品溶液；另取甘油三酸酯、膽固醇與棕櫚酸對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，用上述混合溶液分別溶解并定量稀釋制成每1ml中各含0.6mg、0.4mg、0.2mg的甘油三酸酯、膽固醇、棕櫚酸的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、甘油三酸酯對(duì)照品溶液與膽固醇對(duì)照品溶液各5μl，棕櫚酸對(duì)照品溶液1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙-冰醋酸（70∶30∶1）為展開(kāi)劑，置內(nèi)壁貼有展開(kāi)劑濕潤(rùn)濾紙的層析缸中，展開(kāi)后，取出，晾干，噴以10%（W/V）硫酸銅稀磷酸（8%，W/V）溶液，熱風(fēng)吹干，在170℃干燥10分鐘，立即檢視。供試品溶液如顯與對(duì)照品溶液相應(yīng)位置的雜質(zhì)斑點(diǎn)，其顏色與對(duì)照品溶液所顯的主斑點(diǎn)比較，不得更深（即甘油三酸酯不得過(guò)3%，膽固醇不得過(guò)2%，棕櫚酸不得過(guò)0.2%）。

　　有關(guān)物質(zhì) 取本品約125mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加三-甲醇（2∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿與磷脂酰肌醇對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加三-甲醇（2∶1）溶解并定量稀釋制成每1ml約含溶血磷脂酰乙醇胺10μg、20μg、40μg、60μg、100μg，約含鞘磷脂50μg、100μg、200μg、300μg、400μg，約含溶血磷脂酰膽堿50μg、100μg、200μg、300μg、400μg，含磷脂酰肌醇10μg、20μg、60μg、100μg、200μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液20μl注入液相色譜儀，以對(duì)照品溶液濃度的對(duì)數(shù)值與相應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)值計(jì)算回歸方程。精密量取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，用回歸方程計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。含磷脂酰肌醇（PI）不得過(guò)5.0%，溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）不得過(guò)1%，鞘磷脂（SPM）不得過(guò)3.0%，溶血磷脂酰膽堿（LPC）不得過(guò)3.5%，溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和溶血磷脂酰膽堿（LPC）總量不得過(guò)4.0%，上述有關(guān)物質(zhì)總量不得過(guò)8.0%。

　　殘留溶劑   取本品0.2g，置20ml頂空瓶中，加水2ml，密封，作為供試品溶液；另取乙醇、丙酮、乙、石油醚與正己烷各適量，精密稱(chēng)定，加水溶解并定量稀釋制成每1ml中分別約含200μg、200μg、200μg、50μg、27μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照殘留溶劑測(cè)定法（通則0861）試驗(yàn)，用聚苯乙烯-二乙烯基苯為固定液（或極性相近）的毛細(xì)管柱（HP-PLOT/Q，30m×0.53mm，40/μm）為色譜柱；起始溫度為160℃，維持8分鐘，以每分鐘5℃的速率升溫至190℃，維持6分鐘；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）；進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度260℃。頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時(shí)間為45分鐘。各色譜峰的分離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液與對(duì)照品溶液，分別頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含乙醇、丙酮、均不得過(guò)0.2%，石油醚不得過(guò)0.05%，正己烷不得過(guò)0.02%，總殘留溶劑不得過(guò)0.5%。

　　水分   取本品，照水分測(cè)定法（通則0832第一法1）測(cè)定，含水分不得過(guò)3%。

　　蛋白質(zhì) 取本品1.0g，加正己烷10ml，微溫使溶解，溶液應(yīng)澄明；如有不溶物，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，棄去上清液，殘留物加正己烷5ml，攪拌使溶解，同法操作2次，殘留物經(jīng)減壓干燥除去正己烷后，加水lml，振搖使溶解，加縮二脲試液（取硫酸銅1.5g和酒石酸鉀鈉6.0g，加水500ml使溶解，邊攪拌邊加入10%氫氧化鈉溶液300ml，用水稀釋至1000ml，混勻）4ml，放置30分鐘，溶液應(yīng)不呈藍(lán)紫色或紅紫色。

　　重金屬 取本品2.0g，緩緩灼燒炭化，加硝酸2ml，小心加熱至干，加硫酸2ml，加熱至炭化，在500~600℃灼燒至灰化，放冷，依法檢查（通則0821第二法），含重金屬不得過(guò)百萬(wàn)分之五。

　　砷鹽      取本品1.0g，置凱氏燒瓶中，加硫酸5ml，用小火消化使炭化（必要時(shí)可添加硫酸，總量不超過(guò)10ml），小心逐滴加入濃過(guò)氧化氫溶液，俟反應(yīng)停止，繼續(xù)加熱，并滴加濃過(guò)氧化氫溶液至溶液無(wú)色，冷卻，加水10ml，蒸發(fā)至濃煙發(fā)生使除盡過(guò)氧化氫，加鹽酸5ml與水適量，依法檢查（通則0822第一法），應(yīng)符合規(guī)定（0.0002%）。

　　細(xì)菌內(nèi)毒素        取本品，以無(wú)水乙醇充分溶解，進(jìn)一步使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度（該溶液中乙醇濃度應(yīng)小于20%），依法檢查（通則1143），每1g中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于2.0EU。

　　微生物限度       取本品，依法檢查（通則1105與通則1106），每1g供試品中需氧菌總數(shù)不得過(guò)102cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過(guò)102cfu，不得檢出大腸埃希菌；每10g供試品中不得檢出沙門(mén)菌。

　　【含量測(cè)定】氮 取本品約0.1g，依法測(cè)定（通則0704）計(jì)算，即得。

　　磷對(duì)照品溶液的制備 取105℃干燥至恒重的磷酸二氫鉀約0.13g，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取10ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，每1ml中含磷（P）約為30μg。

　　供試品溶液的制備 取本品約0.1g，精密稱(chēng)定，置坩堝中，加三2ml溶解，加氧化鋅2g，蒸去三，緩緩熾灼使樣品炭化，然后在600℃熾灼1小時(shí)，放冷，加鹽酸溶液（1→2）10ml，煮沸5分鐘使殘?jiān)芙?，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

　　測(cè)定法       精密量取對(duì)照品溶液0ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分別置25ml量瓶中，依次分別加水10ml，鉬酸銨硫酸溶液（取鉬酸銨5g，加0.5mol/L硫酸溶液100ml）1ml，對(duì)苯二酚硫酸溶液（取對(duì)苯二酚0.5g，加0.25mol/L硫酸溶液100ml，臨用前配制）lml和50%醋酸鈉溶液3ml，并用水稀釋至刻度，搖勻，放置5分鐘。照紫外-可見(jiàn)分光光度法（通則0401），以第一瓶為空白，在720nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以測(cè)得吸光度與其對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算回歸方程。另精密量取供試品溶液4ml，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下自“依次分別加水10ml"起同法操作，測(cè)得吸光度，由回歸方程計(jì)算含磷（P）量，即得。

　　磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺 照高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。

　　色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)            用硅膠為填充劑（色譜柱Allt1ma Sillica，250mm X 4.6mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85∶15∶0.45∶0.05）為流動(dòng)相A，以正己烷-異丙醇-流動(dòng)相A（20∶48∶32）為流動(dòng)相B；按下表進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為40℃，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)（參考條件：漂移管溫度為72℃；載氣流量為每分鐘2.0L）。

　　取磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰乙醇胺、蛋黃磷脂酰膽堿、鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品各適量，用-甲醇（2∶1）溶解并稀釋制成每1ml中含上述對(duì)照品分別為50μg、100μg、100μg、200μg、200μg、200μg的混合溶液，取20μl注入液相色譜儀，各成分按上述順序依次洗脫，各成分分離度應(yīng)符合要求，理論板數(shù)按蛋黃磷脂酰膽堿峰與磷脂酰乙醇胺峰計(jì)算均不低于1500。

　　測(cè)定法 取蛋黃磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加三-甲醇（2∶1）溶解并定量稀釋制成含蛋黃磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺6個(gè)不同濃度溶液作為對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中蛋黃磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的濃度范圍應(yīng)涵蓋供試品溶液中蛋黃磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺含量的60%~140%。精密量取上述對(duì)照品溶液各20μl注入液相色譜儀中，以對(duì)照品溶液濃度的對(duì)數(shù)值與相應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)值計(jì)算回歸方程；另精密稱(chēng)取本品約15mg，置50ml量瓶中，加三-甲醇（2∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取20μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。用回歸方程計(jì)算磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺的含量，即得。

　　【類(lèi)別】藥用輔料，乳化劑，增溶劑、脂質(zhì)體膜材等。

　　【貯藏】密封、避光，低溫（-18℃以下）保存。。

藥用注射級(jí)蛋黃卵磷脂藥典檢測(cè)方法