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初級(jí)會(huì)員 | 第10年

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SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)量蛋白含量

時(shí)間：2024/12/16
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　　原理
 
　　根據(jù)檢體中蛋白質(zhì)分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。
 
　　SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陽(yáng)離子去污劑(SDS)--SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷具有相同密度，且大大超過了蛋白原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。多肽結(jié)合SDS的量只與其分子量成正比，而與多肽序列無關(guān)，所以SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)。
 
　　當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX。式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。

 

　　操作步驟
 
　　1、凝膠的制備，包括分離膠和濃縮膠(也可直接購(gòu)買成品膠)
 
　　2、電泳步驟：處理樣品——上樣——加入緩沖液——接通電源進(jìn)行電泳——凝膠板剝離——染色——脫色——漂洗——拍照——實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

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