產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
HRbio™ miRNA qPCR Kit miRNA熒光定量PCR試劑盒 | HRF0711 | 50T |
產(chǎn)品描述
HRbio™ miRNA qPCR Kit采用 SYBR Green I嵌合熒光法的原理進(jìn)行miRNA的熒光定量檢測(cè)。本產(chǎn)品包含miRNA qPCR所需要的所有試劑，組分分別是：2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。其中2×miRNA qPCR Mix（含SYBR Green）是專門為miRNA熒光定量檢測(cè)而特別研發(fā)的新一代預(yù)混液形式的qPCR試劑。其中DNA polymerase采用的是抗體修飾的熱啟動(dòng)形式，配合特殊的buffer體系，使得反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并且在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
產(chǎn)品組分
編號(hào) | 組分 | HRF0711（125次×20 μl） |
HRF071-A | 2×miRNA qPCR Mix(with SYBR Green I) | 1.25 mL |
HRF071-B | Reverse primer（10μM） | 55 μL |
運(yùn)輸與保存方法
1.-20°C 避光保存至少 12 個(gè)月，使用前充分融解混勻。
2.2 ×miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短期使用可放在 4°C，避免反復(fù)凍融。
3.Reverse primer(10μM )每次用完置-20°C 保存。
注意事項(xiàng)
1.miRNA 第一鏈cDNA 的加入量不要超過(guò)real time PCR 體積1/10。
2.對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所檢測(cè)miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA（5-10倍或者100倍）。
3.本品中含有熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
4.2 x miRNA qPCR Mix不含參比染料ROX，客戶并根據(jù)qPCR儀器技術(shù)指導(dǎo)決定是否需要加ROX參比染料，用于消除信號(hào)本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差
5.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
6.本產(chǎn)品僅作科研用途！
操作步驟
在室溫融化2 ×miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。
使用時(shí)請(qǐng)將2 ×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經(jīng)輕微離心后使用。如果試劑沒有混勻，其反應(yīng)性能會(huì)有所下降。注：請(qǐng)不要使用振蕩器混勻。
按照下表組分冰上進(jìn)行反應(yīng)液的配制：
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2×miRNA qPCR Mix | 25 | 10 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
miRNA第一鏈cDNA模板 | X | X | - |
無(wú)菌超純水 | To 50 | To 20 | - |
【注】： 使用前務(wù)必充分混勻， 避免劇烈震蕩產(chǎn)生過(guò)多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1- 1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。
b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過(guò)qPCR反應(yīng)總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5- 10倍稀釋，最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的CT值在20-30個(gè)循環(huán)為好。
d) 反應(yīng)體系：推薦使用20μL或50 μL ，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。
e) 體系配制：請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，并使用無(wú)核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
qPCR系列 miRNA熒光定量PCR試劑盒 PCR 循環(huán)（三步法）
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 94℃ | 2-3 min | 1 |
變性 | 94℃ | 10-20sec | 35-45 |
退火 | 60°C | 10-20 sec | |
延伸 | 72℃ | 20 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認(rèn)設(shè)置 1 | ||
PCR 循環(huán)（二步法）
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 94℃ | 2-3 min | 1 |
變性 | 94℃ | 10 sec | 35-45 |
退火/延伸 | 60℃ | 30-34sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認(rèn)設(shè)置 1 | ||
【注】高特異性可選擇兩步法，高效率擴(kuò)增可選擇三步法。
a) 預(yù)變性時(shí)間： 根據(jù)不同模板和引物的具體情況可適當(dāng)縮短至 2 min。
b) 退火溫度和時(shí)間：請(qǐng)根據(jù)引物和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整。
c) 熒光信號(hào)采集（★）：請(qǐng)按照儀器使用說(shuō)明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置，幾種常見儀器的時(shí)間設(shè)定如下：
30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec 以上：Applied Biosystems: 7300
34sec 以上： Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲線： 通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。
| 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
| HRF0011 | Taq DNA Polymerase DNA聚合酶 | 1000U |
| HRF0012 | Taq DNA Polymerase DNA聚合酶 | 5×1000U |
| HRF0021 | 2×HRbio™ Taq PCR Master Mix (Red) | 1mL |
| HRF0022 | 2×HRbio™ Taq PCR Master Mix (Red) | 5×1mL |
| HRF0023 | 2×HRbio™ Taq PCR Master Mix (Red) | 50×1mL |
| HRF0024 | 2×HRbio™ Taq PCR Master Mix (Red) | 100×1mL |
| HRF0025 | 2×HRbio™ Taq PCR Master Mix for PAGE | 1mL |
| HRF0026 | 2×HRbio™ Taq PCR Master Mix for PAGE | 5×1mL |
| HRF0027 | 2×HRbio PCR Master Mix(No Dye) | 1mL |
| HRF0028 | 2×HRbio PCR Master Mix(No Dye) | 5×1 mL |
| HRF0028L | 2×HRbio PCR Master Mix(No Dye) | 100×1 mL |
| HRF0029 | 2×HRbio™ PCR Master Mix (Green) | 1mL |
| HRF0030 | 2×HRbio™ PCR Master Mix (Green) | 5×1 mL |
| HRF0030L | 2×HRbio™ PCR Master Mix (Green) | 100×1 mL |
| HRF0031 | HRbio™ qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) | 1mL |
| HRF0032 | HRbio™ qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) | 5×1mL |
| HRF0033 | HRbio™ qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) | 50×1mL |
| HRF0041 | HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) | 1mL |
| HRF0042 | HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) | 5×1mL |
| HRF0043 | HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) | 50×1mL |
| HRF0051 | HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus) | 1mL |
| HRF0052 | HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus) | 5×1mL |
| HRF0053 | HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus) | 50×1mL |
| HRF0061 | HRbio™ Universal qPCR SYBR Green Master Mix | 1mL |
| HRF0062 | HRbio™ Universal qPCR SYBR Green Master Mix | 5×1mL |
| HRF0063 | HRbio™ Universal qPCR SYBR Green Master Mix | 50×1mL |
| HRF0071 | HRbio™ Probe qPCR Mix hUDG熱啟動(dòng)探針法定量PCR Mix（含抗體修飾熱啟動(dòng)酶 +hUDG） | 500T |
| HRF0081 | HRbio™ Hi-Fi High Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶 | 10U |
| HRF0082 | HRbio™ Hi-Fi High Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶 | 100U |
| HRF0083 | HRbio™ Hi-Fi High Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶 | 500U |
| HRF0084 | HRbio™ Hi-Fi High Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合酶 | 1000U |
| HRF0085 | Profusion™ DNA Polymerase 超高保真DNA聚合酶 | 100U |
| HRF0086 | Profusion™ DNA Polymerase 超高保真DNA聚合酶 | 500U |
| HRF0087 | Profusion™ DNA Polymerase 超高保真DNA聚合酶 | 1000U |
| HRF0088 | 2×Profusion™ PCR Master Mix 超高保真酶預(yù)混液 | 1mL |
| HRF0089 | 2×Profusion™ PCR Master Mix 超高保真酶預(yù)混液 | 5×1mL |
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