利用花粉介導附加超聲波處理進行轉基因，其超聲波各處理參數對花粉萌發(fā)及基因轉化有極大的影響。我們已利用超聲波處理蘋果花粉作了初步的研究，結果表明，超聲波處理的間隙時間不是影響花粉萌發(fā)的主要因素，處理功率、工作時間和處理次數才是影響花粉萌發(fā)的主要因素，而且各因素之間也有一定的影響。因此，我們利用葡萄花粉按四因素二次回歸正交組合旋轉設計確定試驗方案，擬通過該組試驗獲得超聲波處理參數的*組合，并考察因素效應和因素間交互作用的顯著性。
1材料和方法11花粉采集供試葡萄品種為玫瑰香和瑰寶，試材取自山西省農業(yè)*果樹研究所葡萄資源圃。采集兩供試品種即將開放的花朵，摘下花蕾，在室溫下陰干捻碎過篩，收集篩好的花粉，保存于4冰箱內。
12質粒提取采用堿裂解法提取含有GUS報告基因的質粒。
13緩沖液制備緩沖液選用25蔗糖，50mg/LH3BO3，500mg/LCa（NO3）2、4H2O，200mg/LMgSO4、7H2O，100mg/LKNO3。固體培養(yǎng)基是在其中加1的瓊脂。
14超聲波處理選擇功率、處理時間、間隔時間和處理次數4個超聲波處理參數為試驗因素，破碎（恒碩超聲機械專業(yè)創(chuàng)新締造世界*品牌）率和萌發(fā)率為測定指標，按四因素二次回歸正交組合旋轉設計確定試驗方案（，2）。擬通過該組試驗獲得超聲波處理參數的*組合，并考察因素效應和因素間交互作用的顯著性?；ǚ圻M行超聲波處理時均是取002g花粉在1mL液體緩沖液中按試驗方案處理。
處理后的花粉，一部分直接滴在載玻片上，顯微鏡下觀測花粉的破碎率；另一部分播在固體培養(yǎng)基中，在25恒溫下培養(yǎng)2h，顯微鏡下觀測花粉的萌發(fā)率。
花粉萌發(fā)以花粉管伸長超過花粉直徑為標準。
花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數/總花粉數？100；花粉破碎率=破碎花粉數/總花粉數？100.
15GUS檢測加質粒處理后的花粉在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后，在37恒溫下經XGluc染色液染色，顯微鏡下觀測染色情況。染色液成分為1mg/mLXGluc，05mmol/LK3[Fe（CN）6]，05mmol/LK4[Fe（CN）6]，003Triton100，01mol/L磷酸緩沖液（pH70）。
2結果與分析21超聲波處理參數的選擇從可以看出，花粉破碎率過高會大大影響花粉的萌發(fā)，而較低的花粉萌發(fā)率直接影響坐果率。
但破碎率過低，說明強度小，質粒進入花粉的幾率就會大大降低。因此，只有選擇適宜的破碎率，才可兼顧萌發(fā)率和質粒導入的要求，選出*處理參數。
采用SAS軟件對試驗結果進行分析，結果表明，超聲波處理的功率、處理時間和處理次數對花粉破碎率和萌發(fā)率有極顯著影響，而間隔時間對花粉破碎率和萌發(fā)率的影響不顯著，同時功率與處理時間的交互作用顯著，處理時間與處理次數的交互作用極顯著。
考察顯著性檢驗結果，試驗花粉破碎率和萌發(fā)率的穩(wěn)定性，在不破壞DNA的基礎上，超聲波處理參數以功率100120W，處理時間45s，間隙時間26s，處理次數6為*組合選擇范圍。
22GUS檢測花粉和質粒混合后使用較優(yōu)的超聲波參數進行處理，即功率100120W，處理時間5s，間隙時間5s，處理次數6.花粉經處理后，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后用XGluc染液37恒溫進行染色，如果花粉中轉入GUS基因，則花粉及花粉管顯藍色。
本試驗中，在對照中沒有檢測到內源GUS活性，處理檢測到花粉顯藍色均為基因導入GUS內，檢測到花粉的轉化率為4.
3討論葡萄花粉結構的特殊性造成質粒進入花粉困難。在掃描電鏡下觀測到葡萄絕大部分品種的花粉萌發(fā)孔屬三溝孔類型，也就是說這些品種的花粉壁上有3條溝，萌發(fā)孔位于3條溝里，萌發(fā)孔上都附有乳頭狀突起，當花粉開始萌發(fā)時，這個附著物脫落并在這個位置上顯露出圓環(huán)狀的洞，以利花粉的萌發(fā)。因此使用超聲波處理使質粒進入花粉內有一定的困難，幾率相對其他果樹低許多。
葡萄花粉含有很多酶、蛋白質、核酸及其他有生命活性的物質，這些物質在花粉保存過程中極易變性，從而導致花粉生活力下降以致喪失。干燥花粉在0保存30d生活力下降56394。本試驗中使用的花粉未經保存時的萌發(fā)率為4550，進行超聲波處理參數選擇時，花粉因保存在4冰箱中時間長，生活力已下降至30.不經過任何處理時，花粉的破碎率為2541，萌發(fā)率為1953.
花粉萌發(fā)過程中，花粉和柱頭釋放的核酸酶均降解外源DNA，可能是導致轉化失敗的重要原因之一。溫度、pH和一些化學試劑能影響花粉中核酸酶活性。如：提高培養(yǎng)基中EDTA或MgSO4濃度等；KNO3或PEG可抑制DNA酶活性而不影響轉化后花粉的萌發(fā)。因此，在試驗中應盡量降低花粉萌發(fā)過程中核酸酶活性，獲得高頻率穩(wěn)定轉化。
植物組織中是否存在內源GUS，關系到在植物遺傳轉化實驗中使用GUS報告基因的可靠性。GUS組織化學檢測的條件因材料而異，細菌GUS通常在pH70的條件下檢測，而植物內源GUS活性檢測的pH則有不同的報道。本試驗中葡萄花粉在pH70條件下沒有檢測到內源GUS活性，大大提高了試驗的可靠性。
超聲波處理各參數對花粉有極顯著影響，而且參數間存在交互作用。因此，用超聲波處理選擇參數時，應考慮其交互作用。各種植物花粉的大小、形態(tài)、花粉壁結構及花粉表面的附著物均對質粒進入花粉內部有極大的影響，因此針對不同種植物、同一植物不同品種，均應選擇合適的培養(yǎng)基和超聲波處理參數，使得利用花粉作為外源基因的載體進行遺傳轉化有更高的轉化效率。
