在ELISA的研發(fā)制備中尤為重要的就是它的指控流程，包括抗原設計及制備篩選，抗體制備，標準品的定量，檢測液的優(yōu)化，試劑盒的組裝，以及各種性能的驗證。對于科研工作者來說，要制備一個好的ELISA kit，需要具備敏感性高，特異性強，重復性好，并且其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便等。下面來看一下ELISA的質(zhì)控控制。

1. 抗原抗體選擇
ELISA檢測原理基于抗原抗體反應，其質(zhì)量影響了試劑盒的性能。對于大分子蛋白抗原，多采用雙抗體夾心法，使用優(yōu)的抗體對，且至少有一種為單抗，配對篩選最佳信噪比的包被和檢測抗體。對于抗原為多肽和小分子（或者偶聯(lián)物），多采用競爭抑制法，抗體的是經(jīng)過驗證的單克隆抗體或者多克隆抗體。
2. 標準品
對于標準品定量的準確性，每個公司對于定量標準和方法可能會有不同，這是企業(yè)標準。試劑盒使用的標準品多為重組蛋白或者單價的小分子， 定量可參考國際標準品，物質(zhì)信息網(wǎng)或者一些大公司，如R&D， Abcam等。標準品的定量直接會決定試劑盒最后樣本的檢測結(jié)果。
3. 天然樣本驗證分析
我們在選擇樣本時，避免使用有外源性污染的樣本，避免血樣本出現(xiàn)溶血、細菌污染，最好使用較新鮮樣本，避免反復凍融。
血清是最為常見的檢測樣本，但是大約40%的血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子RF、補體、交叉反應物質(zhì)和異嗜性抗體等其他物質(zhì)等。避免其發(fā)生的方法有：
①標本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。
②用2-C2H6OS加入到標本稀釋液中使RF降解。
③56℃ 30 min加熱血清使補體滅活。
在樣本檢測中，稀釋對于實驗的成功也至關(guān)重要，稀釋過度以及稀釋不足均有可能導致樣本的測值低。Elisa 實驗較為常見的一個現(xiàn)象就是鉤狀效應，即抗原與抗體比例不合適而導致假陰性的現(xiàn)象，抗原過量稱為后帶效應。當樣本中目標物含量很高，而沒有進行正確的稀釋，就有可能會導致假陰性反應。
4. 陽性及陰性對照
用于評判試劑盒以及當次檢測結(jié)果的客觀性和可信性。陰性對照一般選擇blank或者一定不含有受檢物質(zhì)的樣本；而陽性對照是經(jīng)檢驗呈現(xiàn)陽性結(jié)果的樣本，其含量可用于評判當次ELISA檢測結(jié)果的準確性和客觀性。
5. 特異性
包括交叉反應和干擾效應，在研發(fā)過程中需消除樣本非特異性引起的假陰性和假陽性。在ELISA試劑盒中最為關(guān)鍵抗體一定是經(jīng)過反復檢測的，保證不與相關(guān)的類似物反應。
6. 靈敏度
此標準可評估試劑盒質(zhì)量優(yōu)良的一個關(guān)鍵因素，這是由使用的抗體效價等決定的，在研發(fā)過程中，一般會優(yōu)化保證高靈敏度、低背景的檢測結(jié)果從而大大提供試劑盒的靈敏度。
7. 精密度
即為同一樣本重復測定的符合程度，可分為批內(nèi)精密度和批間精密度。一般是選取同一批次或者不同批次的試劑盒對不同濃度的樣本進行定量檢測，需要盡量降低批次差異帶來的系統(tǒng)誤差，保證相同樣本結(jié)果的重復性。一般在研發(fā)過程中使用多個樣本檢測不同批次進行對比，保證試劑盒通過穩(wěn)定性和重復性的檢測。一般廠家的kit需要保證批內(nèi)批間CV%<20%。
8. 線性
樣本經(jīng)梯度稀釋后檢測分析即為線性分析，此過程也是用于消除樣本的基質(zhì)效應?；|(zhì)效應導致的結(jié)果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時就可以辨別出來，當存在基質(zhì)效應時樣本的稀釋線性就不會滿足，說明該類樣本有可能不適用ELISA kit，在研發(fā)階段就需要優(yōu)化反應體系等消除基質(zhì)效應帶來的干擾。
9. 回收率
回收實驗可檢測試劑盒是否受干擾因子的影響，也是辨別基質(zhì)效應的一種方法。在研發(fā)過程中，一般會采用低、中和高濃度的分析物被摻入到已知濃度的驗證樣本中，進行回收實驗測定，回收率應介于80%-120%，表明試劑盒的性能較好。
10. 穩(wěn)定性
即試劑盒在有效期內(nèi)的穩(wěn)定性。通常采用加速降解的方法來推斷試劑盒的有效期。通常試劑盒在37℃放置一天折合有效期2個月，實際工作中，一般將試劑盒在37℃破壞3-7天后，然后檢測上述指標，觀察是否在范圍內(nèi)。也可留樣至有效期后進行檢驗，來衡量有效期，對于批量大的指標，可將加速降解和留樣檢驗相結(jié)合的方法。
另外，ELISA實驗操作時質(zhì)控標準如下：
1、嚴格按照試劑說明書進行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。
2、加樣后及時放人孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結(jié)合緊附于反應孔周圍，難以清洗徹di。
3、封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導致“花板”的出現(xiàn)。
4、用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導致“花板”的出現(xiàn)。
5、合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。
6、加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。
7、顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。
8、加樣時保持顯色劑不外流;A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產(chǎn)生氣泡。
9、應保證C清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至低限度。從而提高檢測的特異性。并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。