當(dāng)前位置:上海撫生實業(yè)有限公司>>技術(shù)文章>>細胞培養(yǎng)優(yōu)點與基本要求匯集
細胞常規(guī)培養(yǎng)是在細胞房中進行,在超凈工作臺或生物安全柜中,把細胞處理好,根據(jù)需要加入細胞培養(yǎng)基,放入細胞培養(yǎng)瓶/皿或細胞培養(yǎng)板中,再放到帶有5% CO2 的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)的優(yōu)點:
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中,根據(jù)要求可始終保持細胞活力,并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況,包括活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件,可以根據(jù)實際需要進行人為的控制,同時,可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察,這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后,所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞,需要時,可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術(shù):如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備
記錄方式可采用攝影照片、縮時電影、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛
應(yīng)用的學(xué)科領(lǐng)域較為寬廣,如細胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等;
適用的對象范圍廣,從低等動物到高等動物,一種動物的不同年齡階段以及不同組織,都可進行有針對性的研究。
6.研究的費用相對較經(jīng)濟
可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象。
細胞培養(yǎng)基的基本要求:
體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中,因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。
一、營養(yǎng)成分維持細胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面:
1、氨基酸:是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸:纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺,它在細胞代謝過程中有重要作用,所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源,同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。
2、單糖:培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解,六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高,半乳糖低。
體外培養(yǎng)動物細胞時,幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
3、維生素:主要扮演輔酶、輔基的角色。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。
4、無機離子與微量元素:細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素,還需要微量元素,如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
二、促生長因子及激素已證實:各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)(分化或未分化)具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用,如胰島素,它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用,如氫化可的松可促進表皮細胞的生長,泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。
三、滲透壓 細胞必須生活在等滲環(huán)境中,大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞,滲透壓在260-320mOsm/kg的范圍都適宜。
四、pH 氣體也是細胞生存的必需條件之一,所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下,借糖酵解也可獲取能量,但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時,一般置細胞于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物,也是細胞所需成分,它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件,pH值約在7.2~7.4℃在細胞生長過程中,隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強,二氧化碳不斷被釋放,培養(yǎng)液變酸,PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳,很不穩(wěn)定,致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用,可提供更有效的緩沖體系,主要是防止pH值迅速變動,但最大缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2 ,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸,培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題,合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng),并采用開放培養(yǎng),使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶,再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2 濃度(5%),與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。
五、無毒、無污染 體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力,因此培養(yǎng)基應(yīng)達到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染(如細菌、真菌、支原體、病毒等)、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染(如抗體、補體)。對于天然培養(yǎng)基,污染主要來源于取材過程及生物材料本身,應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材,嚴(yán)格操作。對于合成培養(yǎng)基,污染主要來源于配制過程,配制所用的水,器皿應(yīng)十分潔凈,配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。
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