酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，該測(cè)定依賴于抗原-抗體相互作用的原理，并利用酶和比色檢測(cè)來(lái)量化目標(biāo)分子，主要用于檢測(cè)和量化生物樣品中特定蛋白質(zhì)、肽、抗體或抗原的存在。一個(gè)準(zhǔn)確的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作，三者缺一不可。在操作過(guò)程中，經(jīng)常遇到樣本稀釋問(wèn)題，需要進(jìn)行樣本稀釋。

一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，超過(guò)試劑盒檢測(cè)范圍的，一般有這幾種情況。
    樣本值高的可能情況:
1、樣本中待測(cè)物含量過(guò)高。一些高豐度蛋白來(lái)說(shuō)，比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度。

2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后，大量表達(dá)胰島素（INS）。

3、在一些感染性疾病中，大量表達(dá)，比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。

4、疫苗原性研究時(shí)，注射疫苗的小鼠，會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)疫苗的抗體。

5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產(chǎn)物，單克隆抗體純品等。

二.在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題：樣本測(cè)定OD值超過(guò)標(biāo)曲最高點(diǎn)OD值，造成測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋，如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)？咱們先了解下    樣本稀釋容易犯的錯(cuò)誤有哪些？

1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏小。

2、過(guò)度稀釋。過(guò)度稀釋時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏大。

3、稀釋不夠規(guī)范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范，特別是大比例稀釋時(shí)，人為偏差大大增加。

三、如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)呢？樣本稀釋的原則如下：

在查詢背景知識(shí)，或者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了樣本濃度過(guò)高，需要進(jìn)行稀釋，就要根據(jù)以下原則，嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。

1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測(cè)定的OD值，要求落在標(biāo)準(zhǔn)品最高值OD值的半量程內(nèi)，假定標(biāo)準(zhǔn)品最高值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個(gè)范圍附近，計(jì)算的濃度值最為準(zhǔn)確，以這個(gè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，得到的樣本濃度最準(zhǔn)確。

2、稀釋過(guò)程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行稀釋20倍，得到200倍。

3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過(guò)程中，誤差越大。