細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長的過程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)是在細(xì)胞房中進(jìn)行，在超凈工作臺或生物安全柜中，把細(xì)胞處理好，根據(jù)需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，再放到帶有5% CO2 的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果操作不當(dāng)或者條件控制不合適容易受到化學(xué)或者生物因素的污染。凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染，細(xì)胞污染不能全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。細(xì)胞污染根據(jù)污染源主要可以分為化學(xué)性，物理性和生物性污染。
一、化學(xué)性污染
培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。
細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。
玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學(xué)性污染。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水。
動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細(xì)胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實驗時，為了保證實驗的可重復(fù)性，最好選用同一批次的血清。
細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過機(jī)構(gòu)的鑒定，實驗者應(yīng)對上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。
二、物理性污染
物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫 度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變，如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長受抑制甚至細(xì)胞死亡。通過實驗室的合理設(shè)計及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時間后再進(jìn)行實驗，以避免過冷的溫度對細(xì)胞的影響。
三、微生物污染
由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無法挽救的。一般在細(xì)胞受到污染早期或污染較輕時，能及時處理并除去污染物，部分細(xì)胞還有可能得到挽救。
不同的微生物污染物對細(xì)胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細(xì)胞形態(tài)和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細(xì)菌增殖迅速，能在很短的時間內(nèi)抑制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。
1、霉菌污染
種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。
處理：確認(rèn)是霉菌污染，如果細(xì)胞種類不是特別珍貴，直接放棄，并將實驗環(huán)節(jié)消毒。
2、細(xì)菌污染
細(xì)菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養(yǎng)液可預(yù)防和排除個別一般少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生細(xì)菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短時間內(nèi)變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以明確細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養(yǎng)基內(nèi)陸入少量培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)以檢測。
處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時后再換常規(guī)培養(yǎng)液，有時在早期污染時此法有效。細(xì)胞培養(yǎng)中用抗生素多為預(yù)防細(xì)菌污染，一半多聯(lián)合應(yīng)用。一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以除掉，有的抗生素只有抑菌作用而無殺菌效應(yīng)。
3、支原體污染
支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨(dú)立生活的微生物.約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性.可為圓形、絲狀或梨形。
支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6-8.0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。
支原體污染細(xì)胞后.培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁.多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解.因此易被忽視。但個別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢.甚至從培養(yǎng)器皿脫落。為確定有無支原體污染可做如下檢測：
a:相差顯微境檢測；b:熒光染色法；c:電鏡檢查；d:DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法。處理：市場上有多種支原體清除試劑盒，效果比較好。
4、酵母污染
酵母到處存在，并能在合適的環(huán)境中快速生長。酵母污染很容易觀察到，培養(yǎng)物變渾濁，尤其在后期。一般PH值變化很小，嚴(yán)重時，PH值升高。顯微鏡下呈卵圓形或球形顆粒，有些會芽生較小顆粒。
5、病毒污染
組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。
盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
6、細(xì)胞交叉污染
細(xì)胞污染和細(xì)菌污染不同，細(xì)胞污染是由于在培養(yǎng)過程中各種細(xì)胞同時進(jìn)行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養(yǎng)細(xì)胞不同種類之間發(fā)生混亂，細(xì)胞生長特性，形態(tài)發(fā)生變化。有些變化輕微，不易察覺，有些則可能由于污染的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢而最終壓過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞生長的抑制，最終死亡。污染過的細(xì)胞由于種類不純，無法進(jìn)行實驗研究。
7、預(yù)防污染方法
需要考慮的注意事項：
1、進(jìn)入培養(yǎng)間時，保持雙手潔凈。使用肥皂全清洗后，酒精干燥(不用紙巾)；
2、佩戴手套(保證手套可以被消毒)；
3、穿著帶有松緊袖口的實驗服；
4、不要隨便觸碰無關(guān)物品(例如：電話、門把手、甚至說是整理頭發(fā)等)；
5、避免佩戴手表、戒指和其他首飾；
6、脫去在其他地方接觸過動物的衣服；
7、患有感冒的人員需佩戴面罩。
良好規(guī)范的操作：
1、為您的CO2培養(yǎng)箱建立一套日常的標(biāo)準(zhǔn)清洗程序(清潔區(qū)域需要包括培養(yǎng)箱周圍的區(qū)域，特別是培養(yǎng)箱的頂部)；
2、經(jīng)常檢查實驗室的其他設(shè)備是否受到污染(例如：洗手池/離心機(jī)等)；
3、有計劃放置您的培養(yǎng)箱，盡量減少開門時間和不必要的移動；
4、快速開關(guān)CO2培養(yǎng)箱；
5、限制使用同一培養(yǎng)箱的人數(shù)；
6、盡快清除溢出物，之后用酒精清潔；
7、舍棄水純化系統(tǒng)最初得到的水。
注重培養(yǎng)過程：
1、細(xì)胞培養(yǎng)需要經(jīng)常性地檢查是否被污染；
2、使用半個開放培養(yǎng)皿盛放組織培養(yǎng)基。開口放置于培養(yǎng)箱中1至4個小時。蓋上培養(yǎng)皿蓋子。37℃培養(yǎng)24-72小時。觀察現(xiàn)象。
3、早期發(fā)現(xiàn)污染可以提高培養(yǎng)物存活的幾率；
4、不要混用、共享培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基；
5、不要令盛放培養(yǎng)基的容器開口放置過長時間；
6、全被污染的培養(yǎng)涉及物需要用高壓滅菌消毒；
7、盡量使用一次性預(yù)滅菌培養(yǎng)耗材。
手機(jī)版
制藥網(wǎng)手機(jī)版
制藥網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：zyzhan
預(yù)告 
預(yù)告 
預(yù)告 
