摘要：建立了一套利用反相液相色譜和大氣壓化學電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析紅豆杉提取物中微量紫杉烷類化合物的方法。通過研究已知的10種紫杉烷類化合物的保留時間、質(zhì)譜特征，初步建立了一個紫杉烷類化合物的數(shù)據(jù)庫，利用這些數(shù)據(jù)可快速鑒定紅豆杉提取物中已知的紫杉烷類化合物，并能夠?qū)ξ粗衔镒鲆欢ǔ潭鹊慕Y(jié)構(gòu)分析。這種研究方法同樣對其他天然產(chǎn)物特別是微量成分結(jié)構(gòu)分析具有指導作用。
    關(guān)鍵詞：紫杉醇，大氣壓化學電離質(zhì)譜，紫杉烷類化合物
    引 言
    紫杉醇是zui早從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）莖皮中分離得到的一種二萜類化合物，用于治療頑固的卵巢癌和乳腺癌。然而紫杉醇資源有限，極大的限制了它的臨床應用。在紫杉烷類化合物中，許多物質(zhì)都有抗腫瘤活性，還有一些可以通過結(jié)構(gòu)改造合成紫杉醇甚至藥效更好的化合物。無論是研究紅豆杉提取物中的紫杉烷類化合物還是結(jié)構(gòu)改造中的中間產(chǎn)物，都需要而靈敏的分離鑒定手段。液相色譜較早被用于紫杉烷類化合物的分離和紫杉醇的定量分析，質(zhì)譜也被廣泛的應用于紫杉烷類化合物的分析鑒定。實驗研究了紫杉烷類化合物的正離子大氣壓化學電離質(zhì)譜，找到了這些物質(zhì)的質(zhì)譜特征，并建立了利用反相液相色譜和大氣壓化學電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究紅豆杉提取物中微量的紫杉烷類化合物的方法。
    2 實驗部分
    2．1 試劑與儀器
    LCQ Advantage質(zhì)譜儀（美國Thermo Finnigan公司）。乙腈為HPLC純；水由法國Millipore公司的Milli-Q水純化系統(tǒng)制備；甲醇、氯仿、正己烷、乙酸乙酯為分析純；柱層析用硅膠（上海五四化學試劑有限公司，75～150μm）。巴卡亭Ⅲ、10-去乙?；涂ㄍあ蟆⒆仙即?、10-去乙?；?表紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙?；?-表三尖杉寧堿、10-去乙?；?7木糖基三尖杉寧堿、10-去乙?；?7木糖基紫杉醇、10-去乙?；?7-木糖基紫杉醇C、7-表紫杉醇由本實驗室制備，并經(jīng)核磁共振檢測確認。質(zhì)譜條件：全范圍掃描100～1000；殼氣（N2）：65單位，輔助氣（N2）：20單位；放電電流5μA；蒸發(fā)器溫度465℃，毛細管溫度180℃。色譜條件：MetaChem公司的Taxsil-3柱（250mm×4.6 mm）；流動相：乙腈：水（49：51），流速：0.8mL／min，柱溫：35℃。
    2．2 樣品的處理
    取干燥的南方紅豆杉（Taxus mairei）樹皮1kg，粉碎至小于250μm，用甲醇浸提3次（5L×3），每次10h，濃縮浸提液，用正己烷萃取3次（2L×3），正己烷層舍棄，然后用氯仿和水萃取3次（2L×3），氯仿層濃縮干燥。上硅膠柱。以乙酸乙酯：正己烷（1：1）為流動相淋洗，收集相應的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到。
    3 結(jié)果與討論
    3．1 已知的紫杉烷類化合物的分析
    通過分析已有的紫杉烷類化合物可以初步建立一個有關(guān)紫杉烷類化合物的數(shù)據(jù)庫，從而可以快速方便的分析紅豆杉提取物、中間產(chǎn)物。列出用1O種常見的紫杉烷類化合物的分子結(jié)構(gòu)信息、分子量和相對保留時間。利用液相色譜在上述條件下分析這些紫杉烷類化合物，得到各個化合物的相對保留時間，即這些化合物的色譜特征數(shù)據(jù)，從而便于實驗室之間數(shù)據(jù)的比較對照。利用化合物在反相色譜中保留時間的長短還可以大致衡量其親脂性強弱，有助于是解釋未知紫杉烷類化合物結(jié)構(gòu)。
    在液-質(zhì)聯(lián)用中通過質(zhì)譜分析可以獲得相關(guān)化合物分子量以及與結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子的信息，結(jié)合液相分析得到的化合物親脂性的信息，可以快速對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。10種化合物的離子碎片離子說明了這些碎片離子的產(chǎn)生方式。這些化合物的質(zhì)譜有許多共性，所有這些化合物都有與紫杉醇相同的母環(huán)結(jié)構(gòu)，zui后都會生成，m／z=509的母環(huán)特征離子；由于母環(huán)上取代基不同，各個化合物還會生成許多特征的離子，主要包括以下3類：*類是關(guān)于13位上側(cè)鏈的特征離子，許多化合物的側(cè)鏈和紫杉醇的（m／z=286）相似，僅僅是氨基所連的官能團（R1）有所差別。這可以根據(jù)側(cè)鏈離子的荷質(zhì)比加以判斷，比如1O-去乙?；?-木糖基紫杉醇C以戊烷基代替了紫杉醇的苯基，所以它側(cè)鏈的特征離子m／z=280，比紫杉醇小了6；其次如三尖杉寧堿類的側(cè)鏈，氨基上連一個2-丁烯基，所以m／z=264；還有一些在13位沒有連大分子的基團，就不會有相應的特征離子，如10-乙?；涂ㄍ?1I和巴卡亭Ⅲ，它們13位都是羥基，所以沒有相應的碎片離子。第二類是關(guān)于10位上所連的基團的，由于1O位的基團脫去后可以與11位的雙鍵形成能量較低的穩(wěn)定共振結(jié)構(gòu)，所以10位上的基團很容易脫去形成相應的中性碎片丟失，如果10位連的是乙?；瑴史肿与x子就很容易形成60的中性碎片丟失，如果連的是羥基，則易形成18的中性碎片丟失。第三類是關(guān)于7位的，許多化合物在7位有相同的官能團， 只是鍵的空間位置不同，這些化合物的質(zhì)譜基本上是一樣的?？紤]到大部分的紫杉烷類化合物擁有與紫杉醇相似的結(jié)構(gòu)，特別是有與紫杉醇一樣的母環(huán)結(jié)構(gòu)，所以這些物質(zhì)會和紫杉醇及其他的標準紫杉烷類化合物經(jīng)歷相似的裂解途徑。相同的特征離子和中性分子丟失，說明含有相同的結(jié)構(gòu)，相對應的不同離子則說明了結(jié)構(gòu)上的差異。因此，用APCI／MS可以做這類化合物的精細結(jié)構(gòu)解析。
    3．2 液-質(zhì)聯(lián)用分析紅豆杉提取物
    3．2．1 未知化合物分子量的確定圖2是紫杉醇純化過程中一個中間產(chǎn)物的UV圖（227nm）和質(zhì)譜總離子流圖。這兩幅圖有很大的一致性，大部分的化合物通過液相色譜得到了很好的分離，為質(zhì)譜分析創(chuàng)造了良好的條件。由于產(chǎn)物的成分非常復雜，還有一些化合物無法達到*分離，可以憑借質(zhì)譜的質(zhì)量分析能力進行分析。盡管有其他化合物離子峰的干擾，但還是可以判斷保留時間為14.18min的是三尖杉寧堿。
    3．2．2 提取物中紫杉烷類化合物的初步分析 迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了300多種紫杉烷類化合物。由這些化合物的結(jié)構(gòu)式可以知道其分子量，利用質(zhì)譜的選擇離子掃描可以初步判斷某一混合物中是否含有這些化合物，然后再根據(jù)質(zhì)譜的圖譜加以確認。利用選擇離子掃描方式分析上述中間產(chǎn)物而發(fā)現(xiàn)的一些可能的紫杉烷類化合物的色譜圖。對于還未被發(fā)現(xiàn)的新化合物也可以根據(jù)質(zhì)譜圖，對其結(jié)構(gòu)做一些判斷。例如，根據(jù)化合物是否形成m／z=509的母環(huán)特征離子可以判斷該化合物是否有和紫杉醇一樣的母環(huán)。
    3．2．3 未知化合物的質(zhì)譜分析 因為許多紫杉烷類化合物有相似結(jié)構(gòu)，相近裂解途徑，故用APCI／MS可以做這類化合物的精細結(jié)構(gòu)解析。以圖出峰時間為7.21 min的未知化合物為例，說明用質(zhì)譜分析化合物結(jié)構(gòu)的方法。圖顯示了該化合物的大氣壓化學電離質(zhì)譜，對照圖的紫杉醇的質(zhì)譜圖：它的側(cè)鏈形成m／z=268.1的離子，其母環(huán)在脫側(cè)鏈之后該化合物形成了m／z 509.1和527.1的離子，說明該化合物的側(cè)鏈與紫杉醇一樣，而母環(huán)含有與l0-去乙?；?7 表-紫杉醇相似的結(jié)構(gòu)；準分子離子峰的m／z 943.9，比l0-去乙?；?紫杉醇大132.1，同時在該物質(zhì)的圖譜中有準分子離子峰脫去149.9得到的m／z=794.0的離子峰；而且該物質(zhì)在色譜中的出峰時間（7.2l
min）比紫杉醇（15.92min）早，說明該物質(zhì)比紫杉醇親脂性弱；綜合這3項，參照其分子量信息及已有的紫杉烷類化合物的資料，基本可以確定該化合物在母環(huán)上比紫杉醇多一個木糖基，可能是l0-去乙酰基-7-木糖基-紫杉醇。
    3．3 結(jié)論
    本實驗利用液相色譜-大氣壓化學電離質(zhì)譜聯(lián)用研究紫杉烷類化合物標準樣品，得到這些化合物的液相色譜保留時間、質(zhì)譜特征圖譜以及質(zhì)譜裂解規(guī)律等信息，據(jù)此可以建立一個有關(guān)紫杉烷類化合物的數(shù)據(jù)庫，用于紅豆杉的粗提物、純化紫杉醇過程中的中間產(chǎn)物的分析，本實驗所用的方法也適用于其他天然產(chǎn)物的開發(fā)和研究，特別適用于微量成分的分析。
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