核酸提取儀"的原理
核酸提取儀的工作原理
目前核酸提取儀的工作原理主要分為磁珠法和柱法，其中磁珠法占據(jù)當(dāng)前市場的主流地位。
磁珠的工作原理主要是利用磁珠對核酸的特異性識別和高效結(jié)合，通過磁珠吸附核酸達到分離效果。常見的磁珠類型包括氧化鋯磁珠和二氧化硅磁珠。根據(jù)磁珠與液體的分離方法，提煉出磁選機法和抽吸法，其原理和過程相同。
核酸提取儀"的分類
根據(jù)不同類型的儀器。
1)自動液體工作站
自動液體工作站是一個非常強大的設(shè)備，它可以自動分配和吸取液體，甚至通過集成擴增和檢測功能，實現(xiàn)標本提取、擴增和檢測的全自動化。提取核酸只是其功能的一個應(yīng)用，不適合常規(guī)的實驗室提取核酸。一般適用于單一種類標本的實驗要求，一次可抽取非常大量的標本(至少96個，一般為數(shù)百個)。自動化工作站平臺的建立和運行需要相對較大的資金。
2)小型自動核酸提取儀
小型自動化儀器通過操作結(jié)構(gòu)的特殊性，可以自動提取核酸，可以應(yīng)用于任何實驗室。
根據(jù)不同的提取原理。
1)儀器采用離心柱法
離心柱法核酸提取儀主要采用離心機和自動移液裝置相結(jié)合的方法。通量一般為1-12個樣品，操作時間與人工提取幾乎相同。不能提高實際工作效率，而且貴。不同類型儀器的耗材不能通用，只適合資金充足的大實驗室。
2)使用磁珠法的儀器
以磁珠為載體，基于磁珠在高鹽低PH值下吸附核酸，在低鹽高PH值下與核酸分離的原理，通過移動磁珠或轉(zhuǎn)移液體即可實現(xiàn)核酸提取純化的全過程。由于其原理的*性，可以設(shè)計成多種通量，單管或8-96個樣品即可提取。而且其操作簡單快捷，提取96個樣品僅需30-45分鐘，大大提高了實驗效率，成本低廉。因此可以在不同的實驗室使用，是目前市場上的主流儀器。
根據(jù)工作性質(zhì)。
1)手工提取核酸存在操作步驟復(fù)雜、效率低、核酸純度低等問題。
2)全自動核酸提取是利用匹配的核酸提取試劑快速提取樣品核酸，具有操作簡單、準確度高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點。在此疫情中，高通量自動核酸提取儀在大規(guī)模人群核酸檢測中發(fā)揮了重要作用。
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“核酸提取儀"的應(yīng)用
核酸提取儀是生物分子相關(guān)分離純化實驗室中非常重要的儀器，可廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、疾病控制和醫(yī)療、臨床診斷、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域。
1.基因組學(xué)
無論提取樣品的來源是微生物、動物、植物還是病毒，核酸提取儀結(jié)合試劑盒可以快速純化足夠數(shù)量和純度的DNA或RNA。高質(zhì)量的核酸可以滿足下游應(yīng)用的需要(如PCR/實時PCR、基因芯片、Southern印跡和Northern印跡)。
2.疾控中心疾病預(yù)防控制
基于全自動核酸提取儀的快速高通量技術(shù)，可用于解決甲型H1N1流感、兒童手足口病、麻疹病毒等的快速自動化疫情監(jiān)測系統(tǒng)。，提高重大疫情的應(yīng)對能力。
3.臨床樣本的分子診斷
該核酸提取純化系統(tǒng)能夠快速、高通量地處理臨床樣本，提取的核酸可用于后續(xù)的分子診斷。它也適用于福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)的組織樣本。
4.畜牧獸醫(yī)
它能高效、靈敏地提取新城疫病毒、豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、貝氏柯克斯體等。
5.法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用
對于法醫(yī)工作來說，核酸提取的效率和穩(wěn)定性非常重要。核酸提取儀與法醫(yī)樣本核酸提取專用磁珠試劑配合使用時，可從包括煙頭、發(fā)根、軟骨、指甲等不同來源的材料中純化出高質(zhì)量的DNA。
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“核酸提取儀"常見問題及解決方法
1.磁棒核酸提取儀手工提取與電腦提取有顯著差異。
磁棒式核酸提取儀通常使用磁性保護套(攪拌套)轉(zhuǎn)移磁珠并均勻混合液體，深孔板底部使用加熱模塊加熱深孔板孔內(nèi)液體，從而模擬人工操作過程。手工提取的實驗結(jié)果只能說明手工操作過程和試劑光環(huán)沒有問題，轉(zhuǎn)到儀器后要綜合考慮。
磁珠法的一般操作流程:裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫可在手工操作中分步實現(xiàn)。但為了限度避免人工操作，通常在一個孔內(nèi)進行破解和組合?？蛻粢话闶褂镁凭鳛檎辰右?，不僅稀釋了裂解液，也影響了裂解效率。而且由于孔內(nèi)液體溫度上升，酒精揮發(fā)影響鍵合效率。另外，儀器一般采用底部加熱方式，孔內(nèi)溫度無法以儀器設(shè)定溫度為準，不同廠家的儀器加熱效率也會有所不同。所以光這一步就要在電腦上優(yōu)化系統(tǒng)。
2.磁棒核酸提取儀孔位置提取效率不同。
磁條型核酸提取儀一般用卡片或黃色鋼球固定96孔深孔板，底部有槽形加熱片。在進行加熱條件下的實驗時，如果深孔板的孔與底部的加熱槽沒有緊密貼合，會直接影響實驗結(jié)果。這種安靜的情況導(dǎo)致了孔間實驗結(jié)果的不穩(wěn)定。如果發(fā)現(xiàn)一個固定孔的提取結(jié)果總是與其他孔有較大差異，可以考慮儀器的加熱模塊是否有問題，觀察該孔的上游裂孔是否有磁珠殘留，用空白樣品檢查儀器在孔間的磁珠轉(zhuǎn)移能力是否*。
3.磁棒核酸提取儀機器提取中加入的洗脫液體積與實際獲得的核酸溶液體積不同。
目前市場上的磁棒核酸提取儀加熱模塊大多位于96孔深孔板的一、六、七、十二排。一排和七排大部分用作裂解和結(jié)合孔，而第六排和第十二排用作洗脫孔。因為大部分萃取實驗在裂解結(jié)合步驟中需要加熱，而第六排與第七排相鄰，由于熱傳導(dǎo)效應(yīng)的存在，使得熱解加熱時第六列洗脫液的溫度也會升高，從而導(dǎo)致洗脫液的蒸發(fā)。因為洗脫液的體積很小(50μL-200μL)，所以實際得到的核酸溶液的體積與加入的洗脫液系統(tǒng)的體積相差很大。
4.提取的核酸產(chǎn)量低。
A.樣品體積與試劑的比例應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)，以免超過裂解能力。
B.粉碎和研磨的步驟。處理細節(jié)很重要。必須充分研磨，這是提取核酸的條件。
c、在洗脫步驟中，使用足夠的洗脫劑進行洗脫并充分混合，以避免wjdtpod殘留結(jié)塊。
D.實驗耗材要配套。比如不同的吸附柱或磁珠對核酸的吸附能力不同，也會影響核酸的產(chǎn)量。
5.提取的核酸被降解。
A.提取的樣品量應(yīng)符合試劑的比例，并盡量控制樣品量達到適當(dāng)?shù)谋壤?/p>
B.注意每一步都要充分均勻的混合，避免結(jié)塊的殘留影響實驗結(jié)果。
C.在洗脫過程中，如果時間太長或溫度太高，核酸可能會降解。
D.切記樣品不要反復(fù)凍融，提取的樣品要保存在適宜的溫度下，長期保存盡量在-80℃。
6.提取的核酸純度不夠高。
A.樣品量和試劑如裂解物的比例應(yīng)盡可能控制在合適的范圍內(nèi)。
B.攪拌均勻，保證充分開裂，無塊狀殘留物。
C.干燥的步驟要充分，否則可能會導(dǎo)致酒精等雜質(zhì)的殘留。
D.如果磁棒的振蕩幅度過小或混合時間過短，磁珠上的雜質(zhì)殘留會影響磁珠吸附核酸的能力。
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“磁珠核酸提取儀"的常見誤區(qū)
誤區(qū)一:磁珠用的越多，提取效果會越好。
很多老師喜歡在提取效果差的時候加大磁珠的量。他們認為更多的磁珠可以吸附更多的核酸。不得不說，這種想法是不可取的。
磁珠的主要特點是在外加磁場的作用下，能以固態(tài)分散在液體中或從液體中分離出來。任何試劑體系，磁珠與液體的比例都應(yīng)該有一定的閾值。如果超過一定的比例，太多的磁珠會失去分散特性，因為它們不能均勻分散在液體中，在洗滌過程中核酸磁珠和液體之間的接觸效率不能充分增加。過多的磁珠也會吸附更多的雜質(zhì)，對除雜效果影響很大。有時，過多的磁珠會吸附液體體系中起主要作用的蛋白酶、溶菌酶等功能成分，導(dǎo)致整個試劑盒效率低下。在很多情況下，當(dāng)提取效果不好時，減少磁珠的用量是提高提取效果方法。
通常磁珠法試劑盒給出的參比磁珠量略過量，需要增加磁珠量以提高吸附效率的情況并不多。但是，如果確定由于磁珠量不足導(dǎo)致提取效果不好，則可以通過在一定范圍內(nèi)增加磁珠量來提高提取效果。
以GNT-02系列磁珠為例，提取常量樣品(植物組織、全血等)時。)，通常用量為10ul/次；提取微量樣本(如血清游離DNA、口腔拭子等)時。)，磁珠量應(yīng)在15~20ul/次。如果需要超過這個使用量，需要和技術(shù)工程師溝通。
誤區(qū)二:使用的試劑越多，提取效果越好。
破解效果不好？添加更多的裂解溶液。洗滌效果不好？添加更多洗滌液。這是很多客戶在使用套件時的習(xí)慣思維。
但是對于磁珠法來說，每增加一部分液體體積，磁珠的碰撞幾率就會降低，降低磁珠的碰撞幾率會導(dǎo)致吸附率的大幅下降。所以在很多情況下，雖然增加裂解液和洗滌液確實可以增強裂解和洗滌，但磁珠提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，不保證磁珠的碰撞效率就無法保證核酸提取的效率。因此，簡單地增加用于改善提取效果的試劑的量可能不是*有效的。
對于GNT-B02全血基因組DNA試劑盒，裂解液和洗滌液的量分別不得超過400微升/次和500微升/次。如果真的需要對系統(tǒng)進行放大，那么磁珠和樣品的量也要相應(yīng)增加，而且這個放大不一定是成比例的。
誤區(qū)三:洗滌次數(shù)越多，萃取效果越好。
當(dāng)提取的核酸中雜質(zhì)過多時，用戶會考慮多洗幾次，以獲得更純的核酸。增加洗滌次數(shù)確實有利于核酸的純化，但考慮到每次洗滌都會損失一定量的核酸，增加核酸裂解和水解的可能性，一般將洗滌次數(shù)控制在2~4次為宜。
對于GN系列試劑盒，單個凈化試劑盒洗滌次數(shù)為2次，植物和動物試劑盒洗滌次數(shù)為3次，血液試劑盒洗滌次數(shù)為3~4次。
誤區(qū)四:取樣越多，提取效果越好。
當(dāng)樣品不夠新鮮或者核酸含量本身較少時，核酸提取效果往往較差，很多老師會通過多取樣品來增加核酸提取量。
但單純增加樣品量有時會導(dǎo)致雜質(zhì)過多，超過裂解液的裂解能力，降低提取效率。因此，不建議單純增加樣本量來達到增加提取量的目的。
如果由于樣品量不足，提取量確實太低，建議在開始提取前進行富集或濃縮步驟?；蛘咴黾忧懈畹?性以暴露更多的核酸也是一種解決方案。
誤區(qū)五:如果某一種磁珠是好的，那么它應(yīng)該在所有實驗中都很好用。
磁珠的種類很多，不同的粒徑、不同的分散性、不同的磁響應(yīng)時間、不同的包被基基質(zhì)、不同的外部修飾官能團、不同的包被密度、不同的官能團臂長，都會導(dǎo)致磁珠的特性不同。
所以不同的磁珠所適應(yīng)的實驗和系統(tǒng)是不一樣的。就像同樣一種提取核酸的試劑，配方不*一樣，用于提取核酸的磁珠性質(zhì)也不*一樣。
有些磁珠在提取大核酸時表現(xiàn)出更高的吸附效率，有些磁珠更適合提取微量核酸。有些磁珠適用于酸性試劑體系，有些磁珠適用于堿性試劑體系。有些磁珠磁響應(yīng)好但沉降速度快，比較適合磁棒自動提取儀；有些磁珠沉降速度慢，但磁響應(yīng)時間長，更適合移液自動提取儀。
少數(shù)幾種磁珠可以用于所有實驗。除了固定的試劑盒，在大多數(shù)情況下，磁珠和試劑系統(tǒng)必須調(diào)整一段時間。
誤區(qū)六:與某個套件相比，效果不好，就是磁珠不好。
很多客戶在篩選磁珠的過程中，只是在成熟的試劑體系下，簡單的更換等量的磁珠，來比較磁珠的效果。
這樣很容易得出某些磁珠效果不好的結(jié)論，但實際上由于不同的磁珠適用于不同的體系和劑量，往往需要調(diào)整才能得到更好的提取效果。
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購買“核酸提取儀"
核酸提取儀常見的核心參數(shù)有:提取原理、機械原理、提取時間、樣品通量、樣品管容量、針尖頭通量、針尖頭數(shù)、接口、儀器重量、儀器尺寸等。同時，在購買核酸提取儀時，除了上述核心參數(shù)外，還需要考慮以下因素:
1.操作簡單，使用方便。
每次提取時，操作人員只需做安裝工作，布置孔板(提供提取所需的試劑)。整個提取過程不需要人工幫助，儀器自動完成，并盡可能配置中文界面，有利于學(xué)習(xí)儀器的使用和編輯程序，減少新操作人員的誤操作，降低實驗失敗的風(fēng)險。
2.高吞吐量、速度和便利性
根據(jù)不同的應(yīng)用場景，可以實現(xiàn)一次快速處理盡可能多的樣本，在短時間內(nèi)完成提取，從而保證核酸提取的高效、快速和及時。
3.安全、環(huán)保、穩(wěn)定、無污染。
操作中涉及的試劑盒和溶劑要盡量低，對人體無害。
4.低成本和開放平臺
基于成本考慮，試劑耗材的消耗和供應(yīng)周期在采購時也要考慮。盡可能選擇適合不同廠家提取的不同規(guī)格耗材和試劑的兼容性高的儀器。
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