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熒光測定法研究酶動力學(xué)
酶促反應(yīng)是指由一類被稱為酶的特殊物質(zhì)所催化的化學(xué)反應(yīng)。這些物質(zhì)通常是蛋白質(zhì)，通過與分子(稱為底物)的特殊結(jié)合發(fā)揮作用，并在不被消耗或永久改變的情況下將其轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。這種結(jié)合降低了反應(yīng)進(jìn)行所需的活化能，從而加快了化學(xué)反應(yīng)速度。酶作為高度特異性和高效的生物催化劑，廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)過程，包括臨床診斷、藥物開發(fā)、食品和飲料、紡織工業(yè)、生物燃料生產(chǎn)等。了解酶動力學(xué)及其關(guān)鍵參數(shù)對于優(yōu)化此類生物技術(shù)過程的效率和成本效益至關(guān)重要。在下一節(jié)中，我們將討論米氏模型，它作為生物化學(xué)中理解和量化酶動力學(xué)的基本工具，為了解酶的特性和功能提供關(guān)鍵的見解。
米氏模型
一個簡單的酶促反應(yīng)可以描述如下：
其中E是酶，S是底物，ES是酶-底物復(fù)合物，P是生成產(chǎn)物。
當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)高于酶濃度([S]>>[E])時(shí)，在穩(wěn)態(tài)假設(shè)下(ES的生成速率等于其分解速率)
酶促反應(yīng)可以用米氏方程來描述，該方程將反應(yīng)速度v與底物濃度[S]聯(lián)系起來，表達(dá)式為(等式1)：1,2
其中：
♦ v是反應(yīng)速度；
♦ Vmax為最大反應(yīng)速度，即底物使所有酶活性位點(diǎn)飽和時(shí)的反應(yīng)速度；
♦ [S]是底物濃度；
♦ Km為米氏常數(shù)，表示反應(yīng)速度為Vmax值一半時(shí)的底物濃度。
當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度成正比。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速度最終達(dá)到最大值(Vmax)，此時(shí)底物飽和。常數(shù)Km是衡量酶對底物親和力的指標(biāo)。Km值越低表明親和力越高，這意味著酶在較低底物濃度下可以達(dá)到其最大速度的一半。米氏方程對于理解酶動力學(xué)至關(guān)重要，常用于通過實(shí)驗(yàn)測定酶參數(shù)。最常用的方法是比色測定法，它依賴于紫外/可見分光光度計(jì)來測量產(chǎn)物的形成，這種產(chǎn)物對光的吸收通常與底物不同3。熒光測定法也可用于提高動態(tài)范圍和分析靈敏度4,5。本文利用熒光底物3-(4-羥基苯基)丙酸(HPPA)研究辣根過氧化物酶HRP的活性6,7。辣根過氧化物酶(HRP)是免疫測定中最常用的標(biāo)記酶之一，它在有過氧化氫(H2O2)存在的條件下催化多種供氫底物8,9。通過制備不同的底物濃度，并利用FL 6500熒光光譜儀監(jiān)測熒光產(chǎn)物強(qiáng)度隨時(shí)間的變化(λexc=290 nm和λm=410 nm)，構(gòu)建米氏圖。由于溫度是影響酶活性的重要因素之一，本文使用連接到珀金埃爾默F(xiàn)L 6500™熒光光譜儀的Peltier系統(tǒng)來設(shè)置溫度，同時(shí)收集熒光酶動力學(xué)，以研究溫度效應(yīng)。
試劑和方法
磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉二水合物、3-(4-羥基苯基)丙酸(HPPA)、辣根過氧化物酶(HRP)、30%過氧化氫(H2O2)溶液、氫氧化鈉(NaOH)和乙醇(EtOH)均購自默克公司。
試劑制備方法如下：
♦ 磷酸鹽緩沖液0.1 M pH 8.0 250 mL：將4.07 g磷酸氫二鉀和252 mg磷酸二氫鈉二水合物溶解于250 mL MiliQ水中。
♦ 底物HPPA 2.5 g/L(15 mM)溶于5 mL磷酸鹽緩沖液中：首先將0.1 g HPPA溶解于2 mL EtOH(50 g/L)中。取0.25 mL體積，加入4.75 mL磷酸緩沖液中，配制成最終體積為5 mL的HPPA 2.5 g/L磷酸鹽緩沖溶液。
♦ 酶HRP 80 μg/L(2 nM)溶于5 mL磷酸鹽緩沖液中：取0.005 g HRP溶解于25 mL磷酸鹽緩沖液中，制得0.2 g/L溶液。從HRP 0.2 g/L溶液中取0.1 mL體積，加入4.9 mL磷酸鹽緩沖液，得到0.004 g/L濃度。從HRP 0.004 g/L中取0.1 mL進(jìn)一步稀釋，加入4.9 mL磷酸鹽緩沖液中，配制成最終體積為5 mL的HRP 80 μg/L磷酸鹽緩沖溶液。
♦ H2O2 0.24% v/v磷酸緩沖液：從30% v/v H2O2儲備液中取0.04 mL，加入4.96 mL磷酸緩沖液中，配制成0.24% H2O2最終溶液。
將HPPA儲備液(2.5 g/L)稀釋在磷酸鹽緩沖液中，制備不同的底物溶液(覆蓋范圍為0.05~0.5 g/L，最終體積為1780 μL)，以實(shí)現(xiàn)熒光酶測定法。對于每種熒光測定動力學(xué)，底物溶液都是直接在標(biāo)準(zhǔn)的10毫米熒光比色皿中配制的，并等待5分鐘以穩(wěn)定溶液溫度，然后再繼續(xù)添加(溫度由浸入溶液中的外部探針確認(rèn))。然后通過添加50 μL HRP酶(80 μg/L)和170 μL H2O2(0.24%)來啟動酶促反應(yīng)，最終體積為2 mL。在最后一次添加H2O2后，采用Spectrum FL軟件中的動力學(xué)方法開始熒光動力學(xué)數(shù)據(jù)采集，參數(shù)如表1所示。
表1.用于采集HPPA酶動力學(xué)的FL 6500熒光參數(shù)
如圖1所示，將Peltier控制器連接到FL 6500熒光光譜儀以研究溫度對HRP酶參數(shù)的影響。溫度可以在Peltier控制器上手動設(shè)置。
圖1.FL 6500熒光分光光度計(jì)連接到Peltier控制器以采集酶動力學(xué)數(shù)據(jù)
結(jié)果
圖2顯示了在磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中存在H2O2的條件下，在15°C時(shí)使用熒光底物HPPA研究HRP酶活性所獲得的結(jié)果。每次熒光動力學(xué)數(shù)據(jù)采集時(shí)間為30分鐘。該圖顯示了在所有底物濃度的動力學(xué)采集結(jié)束時(shí)在Spectrum FL軟件中所示的數(shù)據(jù)。左圖為相應(yīng)濃度(0.05 g/L-0.5 g/L)的樣品列表，以及軟件根據(jù)計(jì)算時(shí)間得到的初始速度。通過改變起始值和結(jié)束值，可以輕松修改計(jì)算時(shí)間。在本研究中，由于觀察到線性關(guān)系在前5分鐘內(nèi)有效，因此計(jì)算時(shí)間設(shè)定為0至5分鐘。圖2中間部分為所選熒光動力學(xué)情況([S]=0.3 g/L)，右側(cè)部分為反應(yīng)速度隨HPPA濃度變化的米氏圖。在米氏圖下方，報(bào)告了酶參數(shù)Vmax=1148 au/min和Km=0.08 g/L。如米氏圖(圖2右)所示，在低底物濃度下，反應(yīng)速度隨底物濃度線性增加。這是因?yàn)樵诘蚚HPPA]時(shí)，可供結(jié)合的HRP活性位點(diǎn)數(shù)量很高，并且每個底物分子都有很高的概率找到酶。隨著HPPA濃度的增加，反應(yīng)速度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。此時(shí)，底物分子使所有HRP活性位點(diǎn)飽和，幾乎所有可用的酶分子均與底物結(jié)合。底物濃度的進(jìn)一步增加對反應(yīng)速度幾乎沒有影響，因?yàn)樗蠬RP分子都已經(jīng)以最大通量參與催化反應(yīng)。反應(yīng)速度主要受空余酶分子的可用性的限制。
為了更直觀地了解酶參數(shù)，通常使用Lineweaver-Burk圖(圖3，右圖)。它是從米氏方程推導(dǎo)出的雙倒數(shù)圖，其中反應(yīng)速度的倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)繪制如下：
它是米氏方程的線性形式，其中Y軸的截距對應(yīng)于：
X軸的截距對應(yīng)于：
在Spectrum FL軟件中，可以在可用模型的下拉列表中輕松選擇模型：Michaelis-Menten、Lineweaver-Burk、Hofstee、Eadie-Hofstee(圖3左上)。
圖2.15℃時(shí)磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中存在H2O2的條件下HRP對HPPA的酶活性。在熒光動力學(xué)數(shù)據(jù)采集結(jié)束時(shí)，結(jié)果顯示在Spectrum FL軟件中。包含計(jì)算時(shí)間和繪圖模型的樣品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的選定熒光動力學(xué)情況(中)以及包含所得Vmax和Km的米氏圖(右)。
圖3.15℃時(shí)磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中存在H2O2的條件下HRP對HPPA的酶活性。在熒光動力學(xué)數(shù)據(jù)采集結(jié)束時(shí)，結(jié)果顯示在Spectrum FL軟件中。包含計(jì)算時(shí)間和繪圖模型的樣品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的選定熒光動力學(xué)情況(中)以及包含所得Vmax和Km的Lineweaver-Burk圖(右)。
溫度效應(yīng)
使用連接到FL 6500熒光光譜儀的Peltier控制器研究溫度對HRP酶活性的影響。Peltier控制器允許在采集熒光動力學(xué)數(shù)據(jù)的同時(shí)為Peltier比色皿支架設(shè)置特定溫度。圖4顯示了在15°C、37°C和45°C下得到的米氏圖的比較。表2為所得的Vmax和Km。當(dāng)溫度從15°C升高到37°C時(shí)，Vmax從1148 au/min增加到1337 au/min，Km從0.08 g/L增加到0.09 g/L，但酶參數(shù)并未受到溫度從37°C升高到45°C的影響。這可以解釋為，隨著溫度的升高，HRP接近變性溫度50-60°C，由此產(chǎn)生的構(gòu)象變化可以修飾活性位點(diǎn)，進(jìn)而改變其酶活性。
表2. 溫度對酶參數(shù)Vmax和Km的影響
圖4.存在H2O2時(shí)，在15℃(粉色)、37℃(藍(lán)色)和45℃(黃色)獲得HRP對HPPA的酶活性的米氏圖。
結(jié)論
酶促反應(yīng)是許多生物和生物技術(shù)過程的基礎(chǔ)，包括藥物發(fā)現(xiàn)、臨床診斷、食品生產(chǎn)和生物燃料合成。研究酶催化反應(yīng)為理解酶活性的機(jī)制提供了有價(jià)值的見解，有助于實(shí)現(xiàn)具有更高可持續(xù)性、效率和成本效益的過程。本研究在存在H2O2的條件下利用熒光底物HPPA研究了HRP的酶活性。使用FL 6500熒光光譜儀采集一系列底物濃度的熒光動力學(xué)數(shù)據(jù)。米氏圖由Spectrum FL軟件自動構(gòu)建，該軟件還可快捷地提供酶常數(shù)Vmax和Km。將熒光計(jì)連接到Peltier控制器進(jìn)行動力學(xué)數(shù)據(jù)采集，以研究溫度對酶活性的影響。溫度從15°C升高到37°C會導(dǎo)致Vmax增加和Km略微增加，但溫度從37°C升高到45°C時(shí)酶參數(shù)并未受到的影響。這項(xiàng)研究表明，連接到Peltier系統(tǒng)的FL 6500熒光光譜儀對于想要了解酶促反應(yīng)的研究者來說是一個強(qiáng)大的工具。此外，借助Spectrum FL軟件，可以輕松獲得米氏圖和酶常數(shù)，為此類分析提供快速簡便的解決方案。
部件號
參考文獻(xiàn)
1.Srinivasan, B. (2022). A guide to the Michaelis-Menten equation: steady state and beyond. The FEBS journal, 289(20), 6086-6098.
2.Ainsworth, S. (1977). Michaelis-menten kinetics. In Steady-state enzyme kinetics (pp. 43-73). Palgrave, London.
3.Porstmann, T., & Kiessig, S. T.(1992). Enzymeimmunoassay techniques an overview. Journal of lmmunological Methods, 150(1-2), 5-21.
4.Zaitsu, K., & Ohkura, Y.(1980). New fluorogenic substrates for horseradish peroxidase: rapid and sensitive assays for hydrogen peroxide and the peroxidase. Analytical Biochemistry, 109(1), 109-113.
5.Peng, K., Baker, D., Brignoli, S., Cabuhat, J., & Fischer, S.K.(2014). When assay format matters: a case study on the evaluation of three assay formats to support a clinical pharmacokinetic study. The AAPS Journal, 16,625-633.
6.Zaitsu, K., & Ohkura, Y.(1980). New fluorogenic substrates for horseradish peroxidase: rapid and sensitive assays for hydrogen. peroxide and the peroxidase. Analytical Biochemistry, 109(1), 109-113.
7.Jordan, G., Stubenrauch, K. G., Heinrich, J., & Staack. R. F.(2017). 3-(4-Hydroxyphenyl) propionic acid: the forgotten detection substrate for ligand-binding assay-based bioanalysis. Bioanalysis, 9(4), 407-418.
8.Zhang, Z., Lai, J., Wu, K., Huang, X., Guo, S., Zhang, L., & Liu, J.(2018). Peroxidase-catalyzed chemiluminescence system and its application in immunoassay. Talanta, 180, 260-270.
9.Veitch, N. C.(2004). Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry 65(3), 249-259.
10.Chattopadhyay, K., & Mazumdar, S.(2000). Structural and conformational stability of horseradish peroxidase. effect of temperature and pH. Biochemistry, 39(1), 263-270.
11.Pina, D. G., Shnyrova, A. V., Gavilanes, F. Rodriguez, A., Leal, F., Roig, M. G., & Shnyrov, V. L.(2001). Thermally induced conformational changes in horseradish peroxidase. European Journal of Biochemistry, 268(1), 120-126.