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齊一生物科技（上海）有限公司 |  資料大小 |
38.6KB |
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 資料類型 |
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41次 |
葡萄糖含量試劑盒說明書（測組織、細(xì)菌或細(xì)胞）
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：
葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。
葡萄糖含量試劑盒說明書測定原理：
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽和蒸餾水
試劑的組成和配制：
試劑一：0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 25ml×1 瓶，4℃保存；
試劑三：液體 25ml×1 瓶，4℃保存；
葡萄糖提取：
1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水），研磨成勻漿，95℃水浴 10 分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心 10min，取上清液備用。
2、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：蒸餾水體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 蒸餾水），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次），95℃水浴 10 分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心 10min，取上清液備用。
葡萄糖含量試劑盒說明書測定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 505nm，蒸餾水調(diào)零。
2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合，用多少配多少。
3、加樣表（在 EP 管中加入下列試劑）：
試劑（μL） 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測定管
樣本 100
試劑一 100
蒸餾水 100
混合試劑 900 900 900
混勻，置 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴中，保溫 15min，于 505nm 波長處讀取吸光度。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3。空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
葡萄糖含量計(jì)算：
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)=0.5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷Cpr。
2、按樣本鮮重計(jì)算
葡萄糖含量（µmol/g 鮮重）= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)=0.5×(A3-A1)÷
(A2-A1)÷W
3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
葡萄糖含量（µmol/ 104 cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)=0.001×(A3-A1)÷
(A2-A1)
C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5µmol/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
注意：
1、zui低檢測限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot
2、若樣本中存在葡萄糖氧化酶抑制劑，則會造成測定結(jié)果偏低，建議改用 HPLC 法測定。
