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細胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

For Research Use only

僅供研究用

貨號：QYS-239819

比色法 20T

主要用途

細胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酪氨酸酶反應系統(tǒng)中底物酪氨酸氧化后，產(chǎn)生多巴色素，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解懸液樣品中酶活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體和動物細胞，尤其是黑色素細胞和黑色素瘤細胞裂解懸液樣品中酪氨酸酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶（monophenol monooxygenase），又稱為單酚酶（monophenolase）或單酚 二羥基苯丙氨酸：O2 氧化還原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、酵母和動物組織中，其蛋白結(jié)構(gòu)、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個跨膜蛋白，而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細胞（melanocyte）或色素細胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通過催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羥基化（o-hydroxylation）反應變成L-多巴（L-dopamine），進而氧化產(chǎn)生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），從而由多巴色素（dopachrome）轉(zhuǎn)化為黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪氨酸酶活性，嚴重時，會引起色素沉著（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突變將導致I型眼皮膚白化?。╫culocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制劑成為增白化妝品的重要元素。基于底物酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下，產(chǎn)生多巴色素，通過其吸光值的變化（475nm波長），來定量測定酪氨酸酶的活性。其反應系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

底物液（Reagent D） 毫升

陰性液（Reagent E）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或酶標板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后進行下列操作。

• 樣品準備 

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒QYS-237314）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準備

• 準備好上述待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長475nm 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 充入氧氣2分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下（25℃）孵育60分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)

• 樣品測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 充入氧氣2分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：50微克蛋白總量）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下（25℃）孵育60分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)

• 計算樣品活性

• 酶標板測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
• 充入氧氣2分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（50微克蛋白總量）
• 輕輕搖動酶標板
• 室溫下（25℃）孵育60分鐘
• 即刻放進酶標儀檢測，獲得背景和樣品讀數(shù)
• 活性計算

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 測定值由低到高變化；測定持續(xù)60分鐘 
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸（Kojic acid）作為抑制劑對照或陰性對照
• 酪氨酸酶單位活性定義為：在25℃，pH 6.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化產(chǎn)生1 微摩爾多巴色素所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列酪氨酸酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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