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順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書
For Research Use Only
僅供研究用
順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書貨號：QYS-233045
分光光度法 50 管/48 樣
順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義
順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。
測定原理
ACO 催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD+ 還原生成 NADH，導(dǎo)致 340nm 處光吸收上升。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：1mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加 3mL 蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用
試劑七：粉劑×1 支，4°保存；臨用前加 36mL 試劑四充分溶解；
工作液：臨用前在 36mL 試劑七中加入 3mL 蒸餾水、3mL 試劑四、3mL 試劑五、3mL 試劑六充分混勻
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器
或研缽勻漿。
2、將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) 600g，4℃離心 5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。
5、在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。
測定步驟
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
（1）將工作液，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。
（3）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 樣本 900μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s
時(shí)的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
ACO 活性計(jì)算
用石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。
ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。
ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=108×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。
ACO 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.722×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.001 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
