超聲波提取馬鞭草中黃酮類化合物的工藝研究

      
　　馬鞭草Verbena officinalis L.又叫鐵馬鞭、自馬鞭、瘧馬鞭，皆以穗類鞭鞘而得名。為馬鞭草科（Verbenaceae）多年生草本植物馬鞭草的全草或根。常生于河岸、草地、荒地、路邊、田邊及草坡等處，全國(guó)各地均有分布［1］。體內(nèi)富含糖、淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、黃酮、類胡蘿卜素等許多活性成分［2］。藥用部分為其全草或帶根全草，作為一種傳統(tǒng)的中草藥，具有清熱解毒、截瘧殺蟲、治痢、利水消腫、通經(jīng)散瘀等功效，被廣泛用于治療傷風(fēng)感冒、水腫、痢疾、黃疸等病癥［3］。現(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)馬鞭草具有抗癌［4］、抗早孕［5］以及免疫調(diào)節(jié)作用［6］。
    
　　有文獻(xiàn)報(bào)道馬鞭草中黃酮類化合物的提取方法采用乙醇提?。?font face="??">2］， 但是，這種方法的提取效率仍然較低。近年來(lái)，超聲技術(shù)應(yīng)用于提取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)、動(dòng)物組織漿的毒質(zhì)等研究已有報(bào)道［7～9］，表明其具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)。很多研究表明，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，并且還可避免高溫對(duì)提取成分的影響［10］。超聲技術(shù)應(yīng)用于提取馬鞭草中黃酮類化合物的研究尚未見報(bào)道,本文報(bào)道用超聲波提取馬鞭草黃酮類化合物及鑒別。

　　1 材料

　　1.1 儀器  

　　UV-752紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；AL104 電子天平（Mettler-Toledo儀器公司）；KQ-500DE型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；F120型粉碎機(jī)（北京中儀金葉科技有限公司）；pH213型酸度計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鄭州市亞榮儀器有限公司）。

　　1.2 試劑　

　　95%乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鋁、鎂粉、正丁醇、氨水、鹽酸、冰醋酸、乙酸鎂、醋酸乙酯（均為AR）；蘆丁標(biāo)樣（含量≥98%）由廣東藥學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供；馬鞭草樣品采于湖南省吉首大學(xué)校園內(nèi)，并經(jīng)湖南省藥材公司李樹勝執(zhí)業(yè)藥師鑒定為Verbena officinalis L.全草。

　　2 方法

　　2.1 黃酮類化合物成分提取　

　　取新鮮馬鞭草，洗凈，晾干，粉碎。精密稱取馬鞭草粉末10.0 g，加100 ml 95%乙醇，超聲波提取2 h，抽濾。濾渣再加100 ml 95%乙醇，超聲波提取2 h，抽濾，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至濾液僅剩5～8 ml為止，放置100 ml容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，得待測(cè)樣品溶液。

　　2.2 測(cè)定方法依據(jù)　

　　以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定馬鞭草中黃酮類化合物的含量，加入鋁離子試劑，同時(shí)控制適宜pH值，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。

　　3  結(jié)果

　　3.1  定量實(shí)驗(yàn)-黃酮類化合物的含量測(cè)定

　　3.1.1  波長(zhǎng)的選擇　

　　取樣品溶液適量，在0.5 ml 5%亞硝酸鈉溶液存在的堿性條件下，經(jīng)硝酸鋁顯色后，以試劑為空白參比液在400～700 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定螯合物的吸光度，螯合物于502 nm 波長(zhǎng)處有zui大吸收，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。

　　3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制　

　　分別精密吸取蘆丁對(duì)照液 （0.10mg/ml） 0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10.00 ml容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 ml，搖勻，靜置5 min；再加10%硝酸鋁溶液0.50 ml，搖勻，靜置5 min；再加4%氫氧化鈉溶液5.00 ml，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以試劑作空白，于502 nm處測(cè)吸光度。結(jié)果見表1。根據(jù)表1得回歸方程：A=-1.233 6×10-2+15.011C，r=0.999 8。表1  紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蘆丁對(duì)照液吸光度值（略）

　　3.1.3 提取物含量的測(cè)定　

精密吸取樣品液0.5 ml，置10 ml容量瓶，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備操作測(cè)定吸光度A=0.615，根據(jù)回歸方程：A=-1.233 6×10-2+15.011C，計(jì)算樣品中黃酮類化合物的含量為8.36 mg/g。

　3.1.4 回收實(shí)驗(yàn)　

　　精密量取樣品液1.0 ml，加入標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對(duì)照品1.0 ml （0.1 mg/ml），同“3.1.3”方法操作測(cè)定吸光度，求出平均回收率為99.56%。

　　3.2 定性實(shí)驗(yàn)-黃酮類化合物的鑒別

　　3.2.1 顏色反應(yīng)　

　　乙酸鎂反應(yīng)：取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%乙酸鎂（指質(zhì)量濃度）的甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黃色斑點(diǎn)。

　　鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取乙醇提取液2 ml于試管中加鎂粉，再加入濃鹽酸數(shù)滴（1次加入），在泡沫處呈紫紅色。

　　三氯化鋁反應(yīng)：取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%三氯化鋁（指質(zhì)量濃度）的乙醇溶液，吹干，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點(diǎn)。

　　濃氨水反應(yīng)：取該樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙?jiān)诎彼戏窖?font face="??">2.0 min，立即在紫外光下觀察，呈極明顯的黃褐色熒光斑點(diǎn)。

　　紫外光下呈色反應(yīng)：取該樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈灰褐色并有熒光斑點(diǎn)。

　　3.2.2 紙層析　

　　取樣品溶液15 μl點(diǎn)在濾紙上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5 為展開劑，上行展開3.0 h，取出晾干。噴1%氯化鋁的乙醇溶液，吹干后于紫外光下，可見熒光斑點(diǎn)。

　　4 討論

　　黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，具有很高的藥用價(jià)值。在自然界中zui常見的是黃酮和黃酮醇，其它衍生物還有黃烷醇、查爾酮、雙氫黃（醇）、雙黃酮、異黃酮、花色苷、橙酮及新黃酮類等［10］。天然來(lái)源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過(guò)血腦屏障，進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出諸多功能，如消除疲勞、保護(hù)血管、防止動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抵抗脂肪氧化、抗擊衰老、活化大腦及其他臟器細(xì)胞等功能。此外，黃酮類化合物還具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用［11］。近年來(lái)，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然、低毒、綠色、可再生等特點(diǎn)備受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用已越來(lái)越引起人們的注目。我國(guó)馬鞭草資源十分豐富，分布也極為廣泛。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬鞭草體內(nèi)富含黃酮類化合物，采用超聲波乙醇浸提法，可以達(dá)到省時(shí)、、節(jié)能的目的，提取效率高于傳統(tǒng)方法，樣品的平均回收率達(dá)99.56 %；而且利用該法提取、純化得到的黃酮類化合物，其產(chǎn)率和純度均很高；再者本方法采用全物理過(guò)程，無(wú)任何污染，因此是一條理想的提取黃酮類化合物途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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